慢病毒操作步驟：

以六孔板中的1孔為例，每個(gè)樣品需要1×106個(gè)293T細(xì)胞。

1、取1.5ml滅菌EP管，加入1.5μg包裝混合質(zhì)粒和0.5μg表達(dá)質(zhì)粒以及250μl的無血清培養(yǎng)基。輕柔混勻，室溫孵育5min。

2、取1.5ml滅菌EP管，取9μl 脂質(zhì)體2000l溶于250μl無血清培養(yǎng)基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。

3、將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min

4、用胰酶消化并記數(shù)293T細(xì)胞。用含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

5、在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長培養(yǎng)基，再加入DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。

6、將1ml重懸的293T細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞/ml）加入到平板中。37℃CO2孵箱中孵育。

7、移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）。

7、轉(zhuǎn)染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀。

8、病毒上清-80°C貯存。

包裝出來的慢病毒對(duì)NIH/3T3細(xì)胞達(dá)90%以上感染效率。

慢病毒注意事項(xiàng)

1.在慢病毒感染細(xì)胞前，為檢測病毒上清培養(yǎng)液內(nèi)病毒的活性，并確定病毒與轉(zhuǎn)染細(xì)胞之間的比率，需要確定病毒的滴度。病毒的滴度可以通過轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，然后使用抗體篩選穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染株，進(jìn)行計(jì)數(shù)和數(shù)值統(tǒng)計(jì)。

2. 在慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的過程中zui重要的一步是融合，只有一些較小的慢病毒載體才能轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)細(xì)胞，因此，病毒顆粒的吸附是慢病毒轉(zhuǎn)染的限速步驟。.